Uchovávání mikroorganismů

Pro běžnou potřebu experimentální práce v laboratoři lze uchovávat mikroorganismy jako aktivní kultury na šikmých základních nutričních agarech. Bakterie se očkují zpravidla na TSA, kvasinky a houby např. na SDA, MEA nebo OMA, které se ukládají ve zkumavkách do chladniček a ponechávají při teplotě 4 – 6 °C. U anaerobních nebo bakterií se zpravidla používá vpichu do souvislé vrstvy agarové půdy ve zkumavce.

Agarovým půdám se většinou dává přednost před půdami v kapalném stavu, neboť v případě agarů mohou jedovaté zplodiny látkového metabolismu difundovat do okolí kolonií, kdežto v kapalném prostředí jsou neustále ve styku s mikrobiálními buňkami a snižují jejich životnost.  I přesto je však nutné mikroorganismy na agarech po 2 – 6 měsících přeočkovávat, neboť při vysychání půdy dochází k odumírání mikroorganismů. Trvanlivost kultur na agarových půdách lze tedy prodloužit zamezením jejich vysychání – vhodným překrytím uzávěrů zkumavek hliníkovou folií nebo parafilmem. (Parafilm je speciální fólie často využívaná v mikrobiologii, která je určená k hermetickému utěsnění Petriho misek a zkumavek. Tato fólie je velmi flexibilní a adhezivní – natahuje se až o 200 % a přizpůsobí se i nepravidelným tvarům, tím zabraňuje kontaminaci vzorků a jejich samovolnému odpařování. Parafilm je rovněž odolný vůči kyselinám, alkalickým roztokům a některým organickým sloučeninám).

Metoda uchovávání mikroorganismů se volí zpravidla podle předpokládané doby jejich uskladnění:

• ve formě aktivních kultur ve zkumavkách a na Petriho miskách při 4 °C – krátkodobé uchování
  mikroorganismy je nutné často přeočkovávat (např. bakterie je nutné přeočkovávat po 2 – 3 měsících, mikroskopické houby po 5 – 6 měsících) – záleží na laboratorních podmínkách uskladnění, zejména na teplotě uchovávání (v termostatu při 25 °C v řádu dní, živné médium vysychá)
• ve zkumavkách v agaru ve vpichu – krátkodobé uchování po dobu několika měsíců
• v transportních médiích – střednědobé až dlouhodobé uchování
  mikroorganismy se nanášejí pomocí speciálních sterilních tamponů na tyčince do zkumavky s transportním médiem (např. dle Amiese)
• na porézních materiálech (želatinových discích, kuličkách) – dlouhodobé uchování
• pod sterilním minerálním olejem (vhodné pro houby i bakterie) – dlouhodobé
• v lyofilizovaném stavu (metoda lyofilizace = vymražování, sublimace vody ve vakuu) – dlouhodobé uchování
  výhoda spočívá v tom, že při této metodě nedochází k přímému přechodu vody z kapalného do plynného skupenství, což je v mnohých případech příčina poškození buněčného materiálu; výhodou je také velmi snadná manipulace s lyofilizovanými mikroorganismy
  všechny mikroorganismy však nelze lyofilizovat (metoda lyofilizace je méně vhodná pro mikroskopické houby, u kterých dochází ke snížení životaschopnosti)
• zmrazením na -70 °C (např. v kultivačním médiu s 15 % glycerolu) po malých objemech v hlubokomrazícím boxu, uchovávání dlouhodobé – měsíce, roky v boxech s pevným CO₂, v suchém ledu (-78 °C), běžné hlubokomrazící boxy, případně kryogenní hlubokomrazící boxy (dosahují teploty až -150 °C)
• kryoprezervace – zamražení kultur pomocí velmi nízkých teplot, např. v tekutém dusíku (teplota až -196 °C) nebo v jiných plynech (He, Cr, H); tato metoda umožňuje uchovávání mikroorganismů na neomezeně dlouhou dobu
  nejvhodnějším postupem kryoprezervace je řízené postupné ochlazování s kontrolovanou rychlostí zamražení: ideálně rychlostí 1 °C / min. pro snížení osmotické disbalance i proti nevhodnému formování krystalů vody v buňce (amorfní led), některé odolné bakterie snesou i rychlejší nebo okamžité zamražení – dle rigidity buňky, vhodné je použít kryoprotektanty v ochranném médiu (dimethylsulfoxid, glycerol)

Stěrové tampony s tekutým transportním mediem (Dispolab, Česká republika)

Stěrový tampon s transportním médiem AMIES (Dispolab, Česká republika)

Stolní lyofylizátor AdVantage Pro firmy Biotrade (profesionální lyofilizátor, jehož základem je produktová komora, zajišťující optimální podmínky při lyofilizaci, vlastní proces řídí sondy v komoře nebo dotyková řídící jednotka s možností tvorby a nastavením vlastních programů).

Mikroorganismy uchovávané na želatinových discích v lyofilizovaném stavu

Při oživování lyofilizovaných kultur bakterií v ampulkách se za aseptických podmínek otevře zatavená ampulka podle návodu.

K lyofilizované kultuře bakterií se přidá sterilní pipetou 0,3 ml vhodného tekutého media a promíchá s lyofilizátem. Papírový štítek s označením kultury se vloží na pevnou živnou půdu, suspenze z ampulky se přenese na vhodné agarové medium a při optimálních podmínkách inkubuje.

U lyofilizovaných kultur hub se po otevření ampule přidává 0,3 ml sterilní destilované vody a ampule se ponechá 15 – 20 min stát. Pak se suspenze i s papírovým štítkem přenese na vhodnou živnou půdu a inkubuje několik dnů při optimální teplotě. Veškeré zbytky původních ampulí se likvidují vkládáním do dezinfekčního roztoku a autoklávováním.